荧光分光光度计的基本工作原理与荧光分光光度法

　　荧光分光光度计或荧光计是强大的分析工具。它们与紫外-可见分光光度计有相似之处，因为两者都涉及光被测试样品中的特定分子吸收。然而，在荧光分光光度计中，由于被称为荧光的现象在吸收后发出的光的强度被测量为波长的函数，以产生荧光光谱。

荧光分光光度计的基本工作原理

　　所有分子都包含许多特定于特定分子的离散能级。在分子的基态中，它的电子占据可用的最低能级。然而，当它们从光中吸收适当的能量时，它们可以过渡到更高的水平以形成激发态。这些本质上是不稳定的，因此电子会自发地回落到较低的水平。在这个过程中发出的光是荧光。

　　激发的电子可以回落到各种较低的能级或直接回到基态，导致能量发射低于或等于入射光能。因此，荧光光谱总是出现在比入射光束更长的波长处。由于荧光发射发生在各个方向，但强度远低于入射光束，因此荧光检测器位通过测试样品的光束路径。这可以防止探测器被入射光束淹没。

充分利用荧光分光光度法

　　虽然荧光强度发射比紫外-可见分光光度计中的信号弱得多，但荧光计的检测水平较低。这是因为荧光信号是直接测量的。这与入射光束是分开的，并且可以很容易地以低噪声贡献被放大。然而，在紫外-可见分光光度计中检测低浓度意味着测量大传输信号和原始入射光束之间的非常小的差异，这受到两个光束中存在的噪声的限制。

　　荧光计可以提供多种不同的测量选项：

　　高强度光源，一般覆盖200~750 nm 波长范围，配备基于衍射光栅的单色仪，因此可以将入射光束的波长调整到特定值。这意味着可以使用不同的激发能量来确定测试样品中多种成分的浓度。

　　通过测量随时间变化的荧光强度，可以计算出样品池中发生的反应速率

　　在扫描入射光的波长时记录一系列荧光光谱，可以建立 3 维扫描或激发发射矩阵，其中发射的荧光强度取决于激发和发射波长。这会生成一个荧光指纹可用于测量样品的成分、浓度和环境负荷，用于检查纯度、原料异常、混合物成分、有机降解引起的新鲜度或确定原产地等。