紫外可见分光光度计中准确的高吸光度测量

　　紫外可见分光光度计通过比较穿过样品的光束强度与未放置样品的参考光束的强度来提供定量测量。样品的浓度越高，它吸收的光就越多，因此高浓度测量对应于高吸光度值。然而，在高吸光度下，实际上很少有光到达仪器检测器，对于许多市售的不同分光光度计来说，对这些非常低的信号水平进行准确的线性测量是非常具有挑战性的。如果极低光照水平的测量不是线性的，那么仪器的高吸光度值测量将不准确，不能用于可靠的定量测量。

　　吸光度和线性

　　根据 Beer-Lambert 定律，吸光度 (Abs) 是样品浓度的线性函数。尽管分光光度计实际上测量的是光的透射率。对于只有非常少量的光到达检测器的高吸光度测量，任何影响这些低水平测量的仪器效应都会对测量的线性度产生重大影响。虽然大多数分光光度计指定的可测量吸光度范围在 0 - 4 Abs 之间，但仪器光学器件的质量决定了低光水平下的实际性能。最重要的考虑因素是杂散光和噪声的贡献。

　　杂散光

　　杂散光是从单色仪到达检测器的任何不直接来自测量光束的光，它会影响测量的透射光，如下所示：

　　中档仪器的典型杂散光系数约为 0.05%T，而高端仪器在单色仪版本中的杂散光贡献率约为 0.015%T。然而，具有两个单色器的研究级仪器可提供最佳的线性吸光度范围，杂散光低至 0.00025%T。

　　对于中档仪器，在 3 Abs 范围内由杂散光引起的误差非常显着，并且在 4 Abs 时要高得多，这意味着定量测量应限制在 2 Abs 及以下。对于单色仪仪器，3 Abs 处的误差更小，这意味着它可以用于直到该点的定量测量，但不能达到 4 Abs。然而，在双单色器版本中，误差可以忽略不计，直至 4 Abs。

　　噪音

　　信噪比对于确定分光光度计的灵敏度至关重要。检测系统内的峰间噪声会影响非常小信号水平的测量精度，即高吸光度。系统的光学设计越好，能量吞吐量就越好，这反过来又可以提供非常低的噪声测量。噪声被引用为峰峰值或 RMS 值。RMS 对峰峰值有平滑作用，给出明显更低的噪声值。然而，直接影响低信号电平测量的是峰间噪声，因此峰间噪声是应始终考虑的值。噪声值的典型示例是零吸光度时的 0.0003A 峰间值，但对于顶级仪器，噪声测量值为 0。