分光光度计中比色法详述

　　分光光度计是一种使选定波长的电磁辐射通过溶液并测量溶液吸收(不允许通过)或透射(允许通过)的电磁辐射量的仪器。一种类型的分光光度计使用紫外线 (UV) 波长;例如，这些是导致晒伤的波长。另一种类型使用红外 (IR) 波长，这是最常见的热量。您可能有机会在另一门课程中使用其中一个。我们将在本课程中使用的第三种分光光度计使用可见波长，我们将其视为不同颜色的光，从紫色到红色。由于这些是熟悉的颜色，因此这种类型的分光光度计被称为“色度计”。

　　比色法是一种程序，其中使用比色计以两种方式之一分析溶液的成分，如下所述。我们也可以称之为可见分光光度法，因为我们使用的是可见波长。紫外分光光度法和 红外分光光度法将分别使用紫外或红外波长;当然，这些需要不同的仪器。

　　电磁辐射被吸收的现象在很多方面已经为您所熟悉。例如，将皮肤暴露在阳光下足够长的时间会产生“晒伤”。这是皮肤细胞内的分子吸收阳光中的紫外线辐射的结果。涂抹在皮肤上的防晒霜的目的是提供其他分子在紫外线辐射到达皮肤之前吸收它。重点?分子确实会吸收电磁辐射，并且可以检测到这种吸收。晒伤很痛!在另一个熟悉的例子中，食物中的水分子吸收微波炉中的微波辐射(红外线长端的波长)。很容易发现的结果是食物变热了!

　　假设我们在一杯水中加入一滴绿色食用色素，在另一杯水中加入一滴黄色食用色素。这些食用色素(染料)中的每一种都是不同类型的有机分子。想象一下将这两种溶液放入单独的试管中，并将它们放在窗户灯上。您将它们视为不同的颜色，因为溶液中的染料分子会吸收(即滤除)不同波长的光，并将不同波长的光透射(即允许通过)到您的眼睛。绿色溶液看起来是绿色的，因为这种染料分子主要吸收绿色以外的波长。同样，黄色溶液呈现黄色是因为溶液中的分子不吸收光谱中黄色部分的波长; 因此，主要是黄色波长在通过溶液后到达您的眼睛。因此，被吸收的光的质量(质量意味着类型、种类)取决于溶解在溶剂中的分子类型。不同类型的分子，例如绿色染料与黄色染料，将吸收不同类型(波长)的光。

　　吸收的光量取决于吸收光的溶解溶质的浓度 。如果增加溶质的浓度，将吸收更多给定波长的光。再次使用食用染料的例子，每杯水两滴绿色染料会产生比只用一滴绿色染料制成的溶液略深的绿色。两种溶液都吸收相同的非绿光波长，但在更浓的溶液中吸收的非绿光量更大。溶液吸收(或透射)光的质量和数量之间的区别是生物学中的一个重要区别：定性特性或现象(什么种类或类型)与定量特性或现象(多少/多少)。

　　在某些类型的实验室测试中，研究人员想知道光谱的哪些波长被溶液中的溶质吸收。这可能有助于识别溶质，因为不同类型的分子吸收不同的波长。请注意，每种颜料都有不同的波长分布，它们或多或少会强烈吸收。该轮廓是“峰”和“谷”的痕迹，有些峰的斜坡上可能有“肩部”。了解吸收光谱是光吸收(因变量)随波长(自变量)变化的曲线图。同样，可以根据其吸收波长的特征分布(模式)来识别一种分子。

　　在其他类型的实验室测试中，研究人员希望确定溶液中特定溶质的浓度。在这种比色法的应用中，目标溶质的吸收光谱已经确定。因此，在色度计上，我们选择已知溶质强烈吸收的波长。参考吸收光谱图再次，对于称为藻红蛋白的色素，565 nm 将是最佳波长。我们可以说这是藻红蛋白吸收光谱中最高“峰”的波长位置。现在再次使用那个绿色染料的例子，一系列含有不同浓度染料的试管都会显示为绿色，但绿色的深度不同。这意味着这些溶液都会吸收相同波长但数量不同的光。您的眼睛可以看到管之间绿色深度的相对差异，但色度计会为您量化这些差异，也就是说，将数值分配给进入溶液的光有多少 被吸收以及有多少被透射。被溶液吸收的给定波长的光的相对量称为吸光度 (A)，而进入溶液中不受阻碍地通过的光的比例称为透光率百分比 (%T)。